Vitamín D – dlhá a zaujímavá cesta za jeho objavom

Na začiatku bola krivica a rybí tuk

Vitamín D je známy svojimi účinkami na naše zdravie, ale len málo sa píše o histórii vzrušujúceho vedeckého bádania po neznámej látke, ktorej nedostatok spôsobuje poruchy rastu kostí u detí a zvierat. Dané ochorenie bolo prvýkrát popísané už v 17. storočí Dr. Danielom Whistlerom (1645) a následne  prof. Francisom Glissonom (1660)  v takmer 380 stranovej latinskej monografii De rachitide sive morbo puerili, qui vulgo The Rickets dicitur Tractatus a nazval ho – rachitída, u nás skôr známa ako krivica [1].

V období priemyselnej revolúcie bolo toto ochorenie tak rozšírené, že prejavovalo až znaky epidémie. V Anglicku malo diagnostikovanú krivicu 60 – 80% detí z chudobných rodín. Ochorenie sa sústreďovalo najmä v oblasti veľkomiest, pôvodne roľnícke obyvateľstvo v Anglicku prichádzalo kvôli dlhom o pozemky a namiesto práce na poli museli pracovať v manufaktúrach. Dovtedajší pobyt na slnku vymenili za šero tovární a znečistené veľkomesto následkom, čoho sa im vytváralo málo vitamínu D, čo viedlo ku krivici. Ale krivica sa neviazala len na ranný novovek. Dokonca sa našli aj pozostatky neandertálskeho človeka postihnutého krivicou, ktorý žil približne 50 000 rokov pred Kristom [2].

V dnešnej dobe je toto ochorenie vo vyspelých krajinách ojedinelé, na druhej strane v niektorých rozvojových krajinách je ešte dosť rozšírené vzhľadom na nižšiu úroveň zdravotnej starostlivosti. Krivica sa prejavuje najmä v kojeneckom veku poruchou rastu kostí. Kosti sú kvôli nedostatku vápnika mäkšie a vplyvom váhy sa deformujú, čím vznikajú napríklad aj tzv. „nohy do O“. V lekárskych encyklopédiách z 19. storočia sa vznik tohto ochorenia pripisoval poruchám metabolizmu minerálnych solí, najmä však vápnika a fosforu. V roku 1882 Trousseau odporučil užívanie rybieho tuku u pacientov trpiacich krivicou, pričom sa predpokladá, že rybí tuk sa používal dávno predtým ako domáci liek [4]

Zlom vo vedeckom bádaní nastal, keď Hopkins v roku 1906 na základe skúseností s liečbou ochorení beri-beri (nedostatok vitamínu B1) a skorbutu (nedostatok vitamínu C) označil krivicu za ochorenie vznikajúce absenciou neznámej látky vitamínového charakteru v potrave [5]. Na ďalšie bádanie bolo potrebné zabezpečiť množstvo pokusných zvierat postihnutých krivicou. Tento oriešok sa podarilo rozlúštiť Mellanbymu, keď dokázal pomocou krmiva vyvolať krivicu u viac ako 400 psov. Nakoniec sa mu pomocou testov na psoch podarilo potvrdiť Hopkinsovu domnienku. V podobnom duchu ako Mellanby viedol výskum aj McCollum s kolektívom, ktorým sa v roku 1921 pomocou špeciálnej diéty podarilo vyvolať typické príznaky krivice u potkanov [6].

Čo ak je za tým vitamín A?

V tej dobe už bolo známe, že rybí tuk obsahuje vitamín A, a preto sa Mellanby domnieval, že tzv. antirachitický faktor je buď totožný s vitamínom A, alebo sa nachádza v potravinách, ktoré ho obsahujú [7].

Keďže vďaka práci McColluma a Mellanbyho mali vedci dostatok pokusných zvierat, mohli si dovoliť rozdeliť zvieratá na skupiny a každej skupine ozvláštniť jedálniček inou prísadou. Týmto spôsobom dokázali zhodnotiť antirachitické vlastnosti rôznych druhov potravín, resp. získali prehľad o obsahu vitamínu D v týchto potravinách, len vtedy o tom ešte nevedeli. Dokázali, že Mellanbyho domnienka o antirachitickej aktivite vitamínu A nebola správna, keďže prídavkom masla s obsahom vitamínu A do stravy pokusných zvierat nedošlo k žiadnemu zlepšeniu ich zdravotného stavu. Zároveň zistili, že upravený rybí tuk zbavený vitamínu A procesom oxidácie a ohrevom si zachoval rovnakú účinnosť pri liečbe krivice ako pred úpravou. McCollum na základe toho pomenoval novú zatiaľ neznámu látku ako vitamín D [6]!

Teda, čo bolo v tom tuku také účinné?! Na to sa určite pýtal aj Pappenheimer so svojím kolektívom, ktorým sa nakoniec podarilo poodhaliť z toho tajomstva. V roku 1922 zmýdelnili rybí tuk a zistili, že antirachitický faktor (faktor potláčajúci krivicu) je prítomný v nezmýdelniteľnej časti rybieho tuku. Inými slovami, zistili, že antirachitické vlastnosti nepatria žiadnej mastnej kyseline [8]. Teda do tej doby výskumníci vedeli nasledujúce 4 fakty:

1. vitamín A nie je to čo hľadáme,
2. látka, ktorú hľadáme je stabilná voči zvýšenej teplote a oxidácii,
3. nejedná sa o mastnú kyselinu,
4. nejakú úlohu v tom všetkom zohráva slnečné žiarenie.

Slnko ako liek

Áno, presne tak – slnečné žiarenie! Už v tej dobe bolo totiž známe, že krivicu je možné liečiť pobytom na Slnku alebo vhodnou diétou, len sa ešte nevedelo ako to je celé prepojené. Aby sme porozumeli ako vedci prišli na to, že práve ultrafialová oblasť je zodpovedaná za liečivé účinky Slnka pri liečbe krivice, začneme pekne od začiatku. Už koncom 19. storočia bolo totiž vďaka práci vedcov A. Hirscha a T. A. Palma známe, že štatisticky menej prípadov krivice je v krajinách na juhu s dostatkom slnka a naopak viac v severských krajinách.

No zatiaľ čo Hirsch sa snažil vytvoriť mapu, kde boli zakreslené zóny s prevalenciou krivice a do svojich argumentov zahŕňal zaľudnenosť, kvalitu ovzdušia a pôdy, Palm sa zameral na Slnko [9 – 10]. Dokonca v jednej so svojich prác odporúčal „systematické slnečné kúpele“ ako súčasť terapie proti krivici [11]. Palm sa vďaka svojim prácam aj napriek tomu, že boli do istej miery nejasné a mnohými lekármi spočiatku ignorované, významnou mierou podieľal na rozvoji fotobiológie.

Predsa len sa našli vedci, ktorý sa snažili Palmovu tézu overiť v praxi. Prvým z nich bol v roku 1913 Raczynski, ktorý zistil, že šteňa chované počas 6 týždňov na slnku malo viac fosforu a vápniku v kostiach ako šteňa chované v tme [12]. V roku 1919 zaznamenal Dr. Huldschinsky prvé úspechy pri liečbe štyroch nemeckých detí postihnutých krivicou a to dokonca použitím umelého svetla ortuťovej výbojky. Ako neskôr ukázal, tak liečivý efekt slnečného žiarenia nie je lokalizovaný, keďže ožiarením len jednej ruky sa uzdravili obe ruky [13]. V tom čase trpela na krivicu až polovica nemeckých detí. Jeho práce vzbudili veľký ohlas.

O 3 roky na to Hess s kolektívom zistili, že šteňatá chované síce na slnku, ale za sklom neboli vyliečené, a keďže vedeli, že bežné tabuľové sklo absorbuje ultrafialové žiarenie, domnievali sa, že liečivé účinky Slnka pripadajú práve tejto oblasti žiarenia. Ich hypotéza bola potvrdená v roku 1924 štúdiou, pri ktorej autori ožarovali rôzne druhy potravín, hlavne tukov pomocou UV žiarenia a následne nimi kŕmili pokusné zvieratá. Zistili, že niektoré potraviny mali po ožiarení výrazne vyššiu účinnosť pri liečbe krivice ako pred ožiarením.

Od rybieho tuku k ergosterolu – vitamín D₂

V tomto bode začínajú vedci kombinovať chemické postupy s ožarovaním UV svetlom. Keďže Pappenheimer zistil, že vitamín D sa nachádza v nezmýdelniteľnom podiele rybieho tuku, boli robené úspešné pokusy o vitamináciu tohto podielu pomocou UV svetla. Z daného podielu sa podarilo izolovať surový cholesterol, ktorý rovnako ožiarením zvyšoval svoju aktivitu proti krivici, ale ako zistili Rosenheim a Webster nebol to cholesterol, ktorý stál za liečivými účinkami surového cholesterolu, keďže čistý cholesterol nie je možné aktivovať UV žiarením [14]. Pomocou tzv. frakčnej kryštalizácie surového cholesterolu sa podarilo oddeliť niektoré frakcie (časti), ktoré absorbovali žiarenie v UV oblasti. Namerané UV absorpčné spektrá porovnali so spektrami dovtedy známych sterolov a zistili podobnosť s ergosterolom.

Prekvapenie prišlo, keď ožiarili ergosterol a zistili, že produkty ožiareného ergosterolu majú až 1000x vyššiu účinnosť proti krivici ako preparáty získané zo surového cholesterolu. Žiaľ nedarilo sa im niekoľko rokov pripraviť kryštalický vitamín, keďže pri ožarovaní ergosterolu vzniká vždy niekoľko rôznych produktov. Zistili však aj jednu nepeknú vec. Na pokusných zvieratách tieto preparáty pôsobili až toxicky. Prejavovalo sa to zvápenatením niektorých vnútorných orgánov a tvorbou kameňov – obličkových, močových, atď. Na druhej strane je dobré poznamenať, že zvieratám podávali v tom čase až tisícnásobne väčšie dávky ako je súčasná odporúčaná denná dávka. Medzi vedcami sa vtedy kvôli tomu strhla diskusia, či môže mať terapeutický aj toxický účinok jedna a tá istá látka. Samozrejme, že môže. Už Paracelsus v 16. storočí vyslovil dodnes známu a platnú tézu:

“Omnia sunt venena, nihil est sine veneno. Sola dosis facit venenum. – Všetko je jedovaté, nič nie je bez jedu; len veľkosť dávky spôsobuje, či niečo je alebo nie je jed.”

Paracelsus

Dnes tomuto stavu, ktorí vedci vyvolali extrémnymi dávkami, hovoríme hypervitaminóza. Oni to však v tej dobe ešte nevedeli, a preto sa Windaus (držiteľ Nobelovej ceny za chémiu z roku 1928 pre jeho prácu pri opise sterolov a ich vzťah s vitamínmi) v roku 1932 podujal, že skúsi rozdeliť zmes látok v ožiarenom ergosterole na toxické a liečivé zložky (Pre zvedavcov: vybral si na to Dielsovu-Alderovu reakciu anhydridu kyseliny maleínovej s dienovými zlúčeninami obsahujúcimi konjugované dvojité väzby, ktorú vykonal v neutrálnom prostredí pri laboratórnej teplote. Produkty fotopremeny oddelil od nezreagovaného ergokalciferu pomocou digitonínu, ktorý dáva s ergosterolom nerozpustnú zrazeninu. Produkty rozdelil na základe ich reakcie s meleínovým, príp. citrakínovým anhydridom. Prvá časť, ktorá zreagovala s anhydridmi, bola rozpustná v zásaditých roztokoch a mala rovnaké toxické, aj liečivé účinky ako druhá nezreagovaná časť).

Oddelenie toxického a terapeutického faktoru sa mu síce nepodarilo, ale z dietyléterických roztokov frakcii sa mu podarilo vylúčiť kryštály. Takto pripravený preparát, ktorý považoval za chemicky čistú látku označil ako vitamín D₁ [15]. Ako sa neskôr ukázalo, jednalo sa o zmes ergosterolu a lumisterolu v pomere 1:1, a preto sa označenie vitamín D₁ v dnešnej nomenklatúre nepoužíva. Súbežne s Windausom sa podarilo Angličanom pod vedením Angusa izolovať z ožiareného ergosterolu látku, ktorú pomenovali ergokalciferol – vitamín D₂ [16].

Od ergokalciferolu k cholekalciferolu – vitamín D₃

Žiaľ, ako ukázali biologické testy, ergokalciferol bol účinný len pri liečbe potkanov a pri liečbe hydiny bol neúčinný, zatiaľ čo rybí tuk mal terapeutické účinky u oboch sledovaných skupín zvierat [17]. To viedlo vedcov k opätovnému štúdiu surového cholesterolu izolovaného z rybieho tuku. Napokon prišiel opäť Windaus s nápadom pripraviť derivát cholesterolu tzv. 7-dehydrocholesterol, pri ktorom predpokladal podobné provitamínové vlastnosti ako má ergosterol. Jeho výsledky  boli fascinujúce. Ožiarením 7-dehydrocholesterolu vznikol cholekalciferol, ktorý mal rovnaký terapeutický účinok ako u potkanov, tak aj u hydiny [18].

Onedlho na to sa podarilo Brockmannovi izolovať z rybieho tuku totožný vitamín ako pripravil Windaus ožiarením 7-dehydrocholesterolu [19]. Tak zistili, že cholekalciferol a nie ergokalciferol je vlastný provitamín pre všetky vyššie stavovce a nazvali ho vitamín D₃. Po jeho úspešnej kryštalizácii určili jeho štruktúru, ktorú zaradili medzi steroidy, konkrétne medzi sekosteroidy. Napriek tomu, že vedeli jeho štruktúru, tak ani nasledujúcich 30 rokov sa neprišlo na to, ako tento vitamín v tele pôsobí. Predpokladali, že cholekalciferol je aktívna forma vitamínu, kofaktor zodpovedný za udržiavanie homeostázy (rovnováhy) vápnika a fosforu v tele.

Rádioaktívne značkovanie – otvorenie nových sfér vedeckého bádania

Ďalší posun nastal až v roku 1955 po objave rádioaktívneho značkovania. Možno sa pýtate, prečo práve rádioaktívne značkovanie? Čo to vlastne je?! Vo svojej podstate, rádioaktívne značkovanie umožňuje použiť tie isté chemické látky pri biologickom výskume, len s tým rozdielom, že niektoré atómy v molekulách skúmaných látok sú nahradené svojimi izotopmi (napr. vodík má 3 izotopy – vodík, deutérium a trícium, ktoré sa líšia len svojou hmotnosťou, ale poskytujú rovnaké chemické vlastnosti) a keďže v tele sa tieto izotopy prirodzene nevyskytujú, je možné sledovať pohyb takýchto látok v tele.

Carlsson a Lindquist použili rádioaktívny  izotop vápnika ⁴⁵Ca²⁺ na to, aby zistili, že dochádza k oneskorenému účinku vitamínu D po jeho podaní. Zvýšenú absorpciu izotopu vápnika z tráviaceho traktu pozorovali až po 36-48 hod. od podania vitamínu D [20]. Zistila sa priama závislosť medzi veľkosťou dávky a rýchlosťou účinku – čím vyššia dávka vitamínu D₃, tým skorší a intenzívnejší bol nástup účinku [21]. Jedným z vysvetlení bolo, že vitamín D musí byť v tele ešte nejako metabolizovaný (premenený), aby bol aktívny.

Tento predpoklad sa potvrdil až s nástupom rádioaktívne značkovaného vitamínu D. Použitím takto upraveného vitamínu sa Normanovi s kolektívom podarilo detakovať 3 rôzne metabolity vitamínu D s terapeutickým účinkom [22]. Onedlho na to sa DeLucovi podarilo identifikovať prvý z nich (pre zvedavcov: jednalo sa o 25-hydroxyderivát cholekalciferolu, ktorý označili ako 25(OH)D₃), ktorý vykazoval 1,5x vyššiu účinnosť ako vitamín D₃. Čoskoro na to sa zistilo, že k premene vitamínu D na 25(OH)D₃ dochádza v pečeni. Mysleli si, že objavili biologicky aktívnu formu vitamínu D [23].

V rovnakom roku prišlo Normanovo laboratórium s objavom polárnejšieho metabolitu vitamínu D v moči sliepok, ktorým podávali vitamín D značkovaný rádioaktívnym tríciom (pre zvedavcov: trícium je rádioaktívny izotop vodíka, ktorý má v jadre okrem jedného protónu aj 2 neutróny a jeho polčas rozpadu je 12,32 roka) [24]. Zistilo sa, že daný metabolit sa nie len že nachádza v jadre a chromatíne buniek zažívacieho traktu, ale že jadrá týchto buniek obsahujú špecifický receptor práve pre neho. Vďaka tomuto zisteniu sa predpokladalo, že účinkuje ako steroidný hormón  [24 – 25]. O rok neskôr, v roku 1970 zistili, že daný metabolit je produkovaný obličkami [26].

Konečne sa v roku 1971 podarilo určiť štruktúru skúmaného metabolitu a to rovno trom tímom vedcov – bol ním 1α,25-dihydroxyderivát cholekalciferolu označovaný ako 1α,25(OH)₂D₃ [27 – 29]. O rok na to biologické testy ukázali, že tento metabolit je tou pravou aktívnou formou vitamínu D, keďže mal 13-15x vyššiu účinnosť v absorpcii vápnika z tráviaceho traktu a zároveň 5-6x vyššiu účinnosť v zvyšovaní množstva sérového vápnika ako vitamín D₃  [30]. Suma sumárum, prišli na to, že po prijatí vitamínu D3, čiže cholekalciferolu, sa ten najprv metabolizuje v pečeni na 25(OH)D₃ a až následne sa metabolizuje v obličkách na biologicky aktívny 1α,25(OH)₂D₃. Objav pôsobenia vitamínu D ako steroidného hormónu znamenal začiatok modernej éry vitamínu D.